Monitoramento em cabine de segurança biológica: manipulação de cepas e descontaminação em um laboratório de micobactérias / Biological safety cabinet monitoring: strains manipulation and decontamination in a mycobacteria laboratory

OBJETIVOS: Verificar evidências da formação de aerossóis durante a manipulação de cepas de micobactérias para teste de sensibilidade às drogas (ANT) e identificação (TIP) e o efeito da descontaminação com solução de álcool 70 por cento e luz ultravioleta (UV) na cabine de segurança biológica (CSB), após os procedimentos laboratoriais. MÉTODOS: Uma placa foi exposta na CSB durante os procedimentos de ANT e TIP. Ao término, a CSB foi limpa e descontaminada com álcool 70 por cento e exposta à luz UV por 15 minutos. Após esse tempo outra placa foi exposta por duas horas, somente com a ventilação da CSB ligada. As placas foram incubadas a 37ºC e observadas por 30 dias. Os esfregaços das colônias isoladas foram corados pelas técnicas de Ziehl Neelsen e Gram, e as colônias de bacilo álcool-ácido-resistente (BAAR) foram identificadas pelos métodos tradicionais. RESULTADOS: Nas 38 placas expostas durante o ANT, cresceram micobactérias em 10 placas (26,3 por cento), fungos em uma (2,6 por cento) e outros bacilos em duas (5,3 por cento). Das placas com micobactérias, oito (80 por cento) foram identificadas como M. tuberculosis e duas (20 por cento) tiveram identificação inconclusiva. Mesmo após a descontaminação com álcool 70 por cento e uso de UV, cresceram fungos em duas placas (5,3 por cento) e cocos em outras duas (5,3 por cento). Nas 30 placas colocadas nas CSB durante a TIP, cresceram micobactérias em 10 placas (33,3 por cento), fungos em duas (6,6 por cento), cocos em uma (3,4 por cento) e uma mistura de micobactérias e outro bacilo em uma (3,4 por cento). Não houve crescimento nas placas expostas após descontaminação das CSB com álcool a 70 por cento e uso de UV ao término da TIP. CONCLUSÃO: Durante os procedimentos houve formação de aerossóis contendo micobactérias, fato que ficou comprovado pelo crescimento de colônias de micobactérias nas placas expostas. Técnicas laboratoriais adequadas devem ser respeitadas para minimizar a formação de aerossóis...

OBJECTIVES: To verify the evidence of aerosol formation during the manipulation of mycobacteria strains for susceptibility (ST) and identification tests (IT) as well as the decontamination effect of alcohol solution 70 percent and ultraviolet (UV) radiation in biological safety cabinets (BSC) after laboratory procedures. METHODS: One plate was exposed in a BSC during ST and IT procedures. Afterwards, the BSC was cleaned and decontaminated with alcohol solution 70 percent and exposed to UV radiation for 15 minutes. After that, another plate was exposed for two hours, only with the BSC ventilation on. Both plates were incubated at 37ºC and observed for 30 days. The smears from the isolated colonies were stained with Ziehl Neelsen and Gram techniques, and acid fast bacilli (AFB) were identified by conventional methods. RESULTS: In 38 plates exposed during ST, there was mycobacteria growth in 10 plates (26.3 percent), fungi in one (2.6 percent) and bacilli in two (5.3 percent). Among those plates that presented mycobacteria growth, eight (80 percent) were identified as M. tuberculosis and two (20 percent) had inconclusive identification. Even after decontamination with alcohol solution 70 percent and UV radiation, two plates presented fungi growth (5.3 percent) and other two presented cocci growth (5.3 percent). Among 30 plates exposed during IT procedures, there was mycobacteria growth in 10 of them (33.3 percent), fungi in two (6.6 percent), cocci in one (3.4 percent) and one (3.4 percent) mixed mycobacteria and another bacillus. No growth was observed when alcohol solution 70 percent and UV radiation were used for decontamination after IT procedures. CONCLUSION: During the procedures there was aerosol formation with mycobacteria, which was proved by mycobacteria growth on the exposed plates. Not only should adequate laboratory techniques be respected to minimize aerosol formation, but professional expertise, the continuity of capacity...

Influência da qualidade das culturas de Mycobacterium tuberculosis nos resultados negativos dos testes da pirazinamidase / Influence of Mycobacterium tuberculosis cultures quality conditions on negative results on pyrazinamidase testing

A Organização Mundial da Saúde recomenda o uso do teste da pirazinamidase (PZAse) como método alternativo para determinação da resistência do Mycobacterium tuberculosis à pirazinamida, por ser um teste rápido e de fácil execução. Foram objetivos deste estudo: verificar a reprodutibilidade dos resultados negativos do teste da pirazinamidase quando realizado a partir das culturas originais e de seus subcultivos e relacioná-los com a qualidade das culturas originais e com os perfis de suscetibilidade à estreptomicina (S), isoniazida (I), rifampicina (R) e etambutol (E). Foram analisadas 115 culturas de Mycobacterium tuberculosis cujos cultivos originais apresentaram resultados negativos no teste da PZAse, o que representa resistência à pirazinamida. A qualidade das culturas foi avaliada, anotada e um segundo teste foi realizado a partir de subcultivos jovens e abundantes. A concordância entre os resultados do primeiro e do segundo teste foi de 72,2% e a qualidade das culturas mostrou correlação com os resultados (p< 0,001). O teste da pirazinamidase é útil quando utilizado juntamente com técnicas de detecção de suscetibilidade às drogas S,I,R,E, desde que seja realizado a partir de cultivos com boa qualidade, que permitam a utilização de inóculo abundante.

The pyrazinamidase is a fast and easy to perform assay, recommended by the World Health Organization as an alternative technique to determine pyrazinamide resistant Mycobacterium tuberculosis strains. This study aimed to assess the reproducibility of negative results on pyrazinamidase assay using both primary cultures and respective subcultures, and to correlate them with original cultures quality, as well as their susceptibility profile to streptomycin (S), isoniazid (I), rifampin (R) and ethambutol (E). A total of 115 Mycobacterium tuberculosis cultures were analyzed, which the original growth produced negative results on pyrazinamidase assay, implying a resistance to pyrazinamide. The cultures quality was assessed and recorded; a second testing was performed using recent and abundant subcultures. Results from the first and the second tests demonstrated an agreement rate of 72.2%, and the cultures quality showed correlation with the results (p<0.001). Pyrazinamidase testing is useful when it is combined with other techniques for analyzing mycobacteria susceptibility to S, I, R, E since it is performed with high quality cultures which allow the use of abundant inocula.

Cabine de segurança biológica: efeito da luz ultravioleta nas micobactérias / Biological safety cabinet: utraviolet radiation effect on mycobacteria

A cabine de segurança biológica (CSB) é o principal equipamento para efetuar a contenção de aerossóis produzidos nos procedimentos laboratoriais e a descontaminação com lâmpada UV, 15 minutos antes do início das atividades e 15 minutos após utilização da cabine é parte das boas práticas de laboratório. O objetivo deste estudo foi avaliar a ação da lâmpada UV da CSB classe II B2, em diversas espécies de micobactérias e correlacionar com o tempo de exposição. Cepas de referência foram subcultivadas, semeadas e incubadas a 37ºC até produzir turvação compatível com o tubo 1 da escala de MacFarland. Foram semeados 100L de suspensão bacteriana em placas com meio 7H11; as placas foram cobertas parcialmente com papel alumínio e expostas à radiação UV durante 5 e 10 minutos. Após exposição, os papéis foram retirados e as placas incubadas a 37ºC por 30 dias. Todas as placas apresentaram inibição de crescimento de bactérias na porção da placa em que houve exposição direta à radiação UV. Os resultados obtidos mostraram que a prática de utilização da radiação UV por 15 minutos após o uso da cabine e antes de iniciar outra atividade técnica, garante descontaminação adequada da CSB. Esta prática de biossegurança é recomendável para descontaminar a própria CSB e os materiais que são retirados da cabine.

Micobactérias não-tuberculosas: diversidade das espécies no estado de São Paulo / Nontuberculous mycobacteria: species diversity in São Paulo state, Brazil

O gênero Mycobacterium é constituído por espécies do complexo M. tuberculosis e outras denominadas micobactérias não-tuberculosas (MNT). Até o momento, mais de cem MNT foram descritas. Os objetivos deste estudo foram avaliar a diversidade das espécies de MNT identificadas no estado de São Paulo, no período de 1991 a 1997, que antecedeu a expansão da terapia anti-retroviral, e determinar a freqüência dos casos que atenderam alguns critérios bacteriológicos para o diagnóstico das infecções causadas pelas MNT. MATERIAL E MÉTODOS: Foram analisadas 1.892 cepas isoladas de sítios estéreis e não-estéreis de 1.248 pacientes atendidos no estado de São Paulo. RESULTADOS: Do total de pacientes, 1.199 (96,1 por cento) tiveram suas cepas identificadas e 3,9 por cento apresentaram resultados não-conclusivos. As dez espécies encontradas foram o complexo M. avium (MAC), M. kansasii, M. chelonae, M. fortuitum, M. szulgai, M. xenopi, M. marinum, M. gordonae, M. terrae e M. nonchromogenicum. Quarenta e sete (7,8 por cento) casos pulmonares tiveram diagnóstico confirmado pelo isolamento da mesma espécie em três ou mais amostras e 67 (34 por cento) pacientes tiveram o diagnóstico bacteriológico confirmado por isolamento em sítios estéreis. CONCLUSÕES: As espécies de MNT mais freqüentemente isoladas no estado de São Paulo foram MAC e M. kansasii. Uma publicação nacional com recomendações para diagnóstico e tratamento dessas infecções seria fundamental para a conduta correta no diagnóstico e no tratamento de micobacterioses.

Molecular characterization of Mycobacterium kansasii isolates in the State of São Paulo between 1995-1998

Mycobacterium kansasii is the most common cause of pulmonary nontuberculous mycobacteria infection and classical identification of this pathogen needs a time consuming phenotypic tests. Polymerase chain reaction-restriction fragment lenght polymorphism analysis (PRA) of the gene enconding for the 65kDa heat shock (hsp65) protein offers an easy, rapid, and inexpensive procedure to identify and subtype M. kansasii isolates. In the present study, we performed a retrospective analysis of patients who had mycobacteria identified on the basis of phenotypic tests by means of a review of database at Mycobacteria Laboratory of the Instituto Adolfo Lutz in the period 1995-1998. A total of 9381 clinical isolates were analyzed of which 7777 (82.9 percent) were identified as M. tuberculosis complex and 1604 (17.1 percent) as nontuberculous mycobacteria. Of the 296 M. kansasii isolates, 189 (63.8 percent) isolates obtained from 119 patients were viable and were analyzed by PRA-hsp65. Hundred eight two (98.9 percent) were classified as M. kansasii type I. Two isolates were classified as type II and III and five isolates were characterized as other Mycobacterium species. Clinical isolates of M. kansasii in the state of São Paulo was almost exclusively subtype I regardless of HIV status.

Cord formation and colony morphology for the presumptive identification of Mycobacterium tuberculosis complex

The identification of Mycobacterium tuberculosis complex (MT), using non-molecular methods, is time-consuming. The objective of this study was to evaluate a screening test for the presumptive identification of MT, which could potentially decrease laboratory turn-around time for reporting preliminary results. From January 1998 to December 1999, 3056 cultures were analysed at the Mycobacterial Laboratory, Instituto Adolfo Lutz, S los o Paulo, Brasil. The screening test consisted of observation of colony morphology on L que wenstein Jensen medium and evaluation of cord formation on smear microscopy from those positive cultures. After the screening test, the cultures identified as non-tuberculous mycobacteria were identified to species by conventional methods (growth on culture and biochemical tests). Those identified as MT were submitted to drug susceptibility tests. The presumptive identification of MT using the proposed screening test, when compared with conventional tests, presented 98.9, 86.9, 97.8 and 93.0 percent of sensitivity, specificity, positive and negative predictive values, respectively. The conclusion is that it is possible to make a presumptive identification of MT using visual analysis of colony morphology and cord formation on microscopy examination. This method could be used to report the presumptive identification of MT and to guide laboratory decisions regarding susceptibility and identification tests with little cost and in a very practical way.

Inibiçäo da adesäo de Escherichia coli enteropatogênica clássica 0111ab:H2 a células HeLa pelo colostro e leite materno em diferentes condiçöes experimetais / Inhibition of the adherence of classical enteropathogenic escherichia coli 0111ab:H2 to HeLa cells by colostrum and human milk in different experimental conditions

A adesäo de Escherichia coli enteropatogénica (EPEC) aos enterócitos, com posterior destruiçäo das microvilosidades, tem sido considerada como o principal mecanismo de virulência desse grupo de bactérias. Essa característica pode ser estudada "in vitro" em culturas de células HeLA ou HEp-2, às quais as EPEC aderem de modo localizado. Neste trabalho mostramos que o colostro e o leite materno inibem a adesäo ade E. coli 0111ab:H2 a células HeLa em diferentes condiçöes experimentais. A lactose parece näo estar envolvida com a inibiçäo "in vitro" da adessäo, uma vez que nenum efeito foi observado quando utilizada no teste na concentraçäo de 5,5%. Além disso, uma curva de crescimento realizada nas mesmas condiçöes que as utilizadas no teste de adesäo näo mostrou efeito bacteriostático do leite. S-IgA e análogos de receptores celulares presentes no leite seriam os prováveis responsáveis pela inibiçäo da adesäo observada